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Leidy Esmirna Mota Rosa

2008-2
UNAD

2011-04-10

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A PESAR DE TODA LA CIENCIA…. DIOS SIGUE ESTANDO AL CONTROL.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR Y FENOTÍPICA DEL GÉNERO PSEUDALLESCHERIA Y GÉNEROS AFINES


Pseudallescheria es un género de ascomicetos caracterizado por ser polimórfico, ya que pueden presentar hasta tres formas morfológicamente diferentes, una forma sexual o teleomorfo y dos formas asexuales o anamorfos (sinanamorfos). Estas dos formas asexuales se clasifican en los géneros anamórficos Scedosporium y Graphium. Pseudallescheria boydi es la especie más importante del género debido a que es considerado un hongo patógeno emergente capaz de producir infecciones graves especialmente en pacientes inmnusuprimidos. Hasta la presente tesis, el anamorfo de P. boydii era Scedosporium apiospermum.

En los últimos años, P. boydii ha sido objeto de diversos estudios moleculares que han mostrado su elevada variabilidad intraespecífica. Otros trabajos han puesto de relieve su variabilidad en cuanto a la respuesta a los antifúngicos así como la diferente virulencia que existe entre sus cepas. Todo ello hacía suponer que en lugar de una sola especie nos hallábamos frente a un complejo de especies. Por esta razón decidimos realizar un estudio molecular y morfológico utilizando numerosas cepas tanto clínicas como ambientales y de diferentes países. Gran parte de las cepas ambientales fueron aisladas por nosotros con la utilización del medio selectivo DRBC con benomilo. El análisis de secuencias parciales del gen de la ß-tubulina (dos loci) y la calmodulina y las regiones ITS del ADNr demostraron que P. boydii es un complejo de especies. El análisis combinado de las secuencias de los 4 loci nos permitió la distinción de 8 especies filogenéticas agrupadas en 4 clados diferentes. Los clados 1 y 2 fueron descritos como las nuevas especies Scedosporium aurantiacum y Pseudallescheria minutispora, respectivamente. El clado 5 consistió en 4 subgrupos incorporando las cepas tipos de P. boydii Pseudallescheria angusta, Pseudallescheria ellipsoidea y Pseudallescheria fusoidea. En el caso de los clados 3 y 4 fueron considerados únicamente como especies filogenéticas en este primer estudio. Posteriormente, para facilitar la identificación de estas 8 especies filogenéticas en laboratorios de microbiología clínica, se estudiaron las características morfológicas macro- y microscópicas mas representativas de todas ellas así como su respuesta a 59 pruebas fisiológicas. Para incrementar la robustez de los diferentes clados, aumentamos el número de nuevos aislados y de éstos se secuenció la región TUB del gen de la ß-tubulina, el cual previamente demostró ser el marcador molecular más informativo de los 4 evaluados. La combinación de estos estudios permitió distinguir fenotípicamente las mencionadas especies filogenéticas. La nueva especie Scedosporium dehoogii (previamente clado 3) fue descrita y Scedoporium apiospermum (previamente clado 4) y P. boydii fueron consideradas como dos especies diferentes. El nuevo nombre Scedosporium boydii fue propuesto para denominar al anamorfo de la última especie. Scedosporium dehoogii pudo ser separada del resto porque no crece a 40ºC y presenta conidioforos no ramificados. Aunque S. apiospermum fue morfológicamente indistinguible del anamorfo de P. boydii ambas especies pudieron ser separadas por su respuesta a las pruebas de la D-ribosa y por la presencia o ausencia de teleomorfo.

Durante la búsqueda de nuevos aislados utilizando el medio DRBC suplementado con benomilo, aislamos un hongo interesante de suelo de Argentina que presentaba una morfología similar a la de Scedosporium. Un estudio más detallado a nivel genético y morfológico nos permitió ver que este hongo era diferente a las especies conocidas de éste y otros géneros relacionados, por lo que propusimos el nuevo género Parascedosporium. Su carácter distintivo es el desarrollo simpodial de los conidios a partir de células conidiógenas denticuladas. Este aislado resultó ser morfológicamente idéntico a Graphium tectonae, por lo que propusimos la nueva combinación Parascedosporium tectonae. El análisis filogenético de las secuencias de 4 regiones de los 3 genes ya trabajados en el primer estudio confirmó nuestra propuesta.

En esta tesis también evaluamos la actividad in vitro de 11 antifúngicos (anfotericina B, albaconazol, fluconazol, itraconazol, ketoconazol, posaconazol, ravuconazol, voriconazol, terbinafina, micafungina y flucitosina) utilizando el método de microdilución del CLSI contra 84 aislados pertenecientes a las 8 especies que constituyen el complejo P. boydii. Encontramos diferencias significativas entre las especies, siendo Scedosporium aurantiacum la más resistente. En general, el voriconazol fue el antifúngico más activo, seguido del posaconazol.

Otro objetivo de la presente tesis fue comparar la virulencia de alguna de las diferentes especies del complejo utilizando un modelo murino con animales inmunocompetentes e inmunosuprimidos. Se seleccionaron 2 inóculos diferentes, 5x104 conidia/mL (para los animales inmunosuprimidos) y 1x106 conidia/mL (para los animales inmunocompetentes). S. aurantiacum y S. dehoogii fueron significativamente las especies más virulentas, causando la muerte del 80% y 70% de los ratones inmunocompetentes, respectivamente, mientras que el resto de las especies sólo consiguió entre un 0% y un 20% de mortalidad.

Finalmente, debido a que ninguna de las cepas estudiadas de la especie más común del complejo, S. apiospermum, había desarrollado la forma sexual, consideramos interesante determinar si se trataba de una especie heterotálica. Para ello, realizamos cruzamientos con 15 cepas de S. apiospermum en todas las combinaciones posibles, incluyendo cruzamientos consigo misma. Algunos cruzamientos entre distintas cepas produjeron ascomas fértiles, mientras que los cruzamientos con subcultivos de una misma cepa resultaron autoestériles. Las cepas pudieron separarse en dos diferentes mating types. Corroboramos el bi-alelismo del sistema de cruzamiento heterotálico mediante cruzamientos entre las ascosporas de la progenie F1 de un cruzamiento positivo. Todos estos datos confirmaron que S. apiospermum es una especie heterotálica.

Revista Cubana de Pediatría

versión impresa ISSN 0034-7531

Rev Cubana Pediatr v.74 n.2 Ciudad de la Habana abr.-jun. 2002
Artículos originales

Centro Nacional de Genética Médica.
Instituto Superior de Ciencias Médicas de La Habana

Caracterización molecular de fenilcetonúricos cubanos

Lic. Enna Gutiérrez García,1 Dra. Bárbara Barrios García,2 Lic. Reinaldo Gutiérrez Gutiérrez3 y Dra. Astrea Damiani Rossel4

Hasta el momento se han descrito más de 500 mutaciones en el gen de la fenilalanina hidroxilasa humana (PHA), distribuidas a lo largo de sus 13 exones, y es el 7 el que posee un número mayor. El hecho de que la fenilcetonuria sea causada por mutaciones puntuales, hace necesario la utilización de un método que permita el análisis rápido de cada individuo. En este estudio se analizó el ácido desoxinucleótico (DNA) genómico de 28 pacientes fenilcetonúricos (PKU) y a sus padres, provenientes de diferentes partes de Cuba. Se realizó amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en los 13 exones, antes de efectuar el método de electroforesis en geles de gradientes desnaturalizantes (DGGE) y secuenciación. Se hallaron 16 mutaciones diferentes en el 91 % del total de cromosomas independientes de los pacientes, y fueron las mutaciones más frecuentes la E280K y la R261Q, que es originaria de Galicia. Se comprobó la herencia mendeliana en los padres. Las mutaciones más frecuentes en Cuba no coinciden con las de España y América Latina.

DeCS: FENILCETONURIAS/diagnóstico; FENILALANINA HIDROXILASA/análisis. FENILALANINA HidROxilasa/genética; MUTACION; ADN; REACCION EN CADENA POR POLIMERASA; ENFERMEDADES HEREDITARIAS; BIOLOGIA MOLECULAR.

El gen de la PAH se encuentra localizado en la región q22-q-24.1 del cromosoma 12; tiene aproximadamente 90 kilobases (kb) de longitud y 13 exones, con intrones de tamaños entre 1 kb y 24 kb, exones entre 57 pares de bases (pb) y 197 pb. Los exones, del 6 al 13, están conformados también por aproximadamente 847 pb de ácido ribonucloico (ARN) mensajero, todo compactado en un fragmento de 16 kb del gen, mientras que los exones del 1 al 5 (509 pb) están separados de grandes intrones, el más pequeño de los cuales tiene 4,5 kb. El ARNm maduro tiene 2,4 kb de longitud. La región codificante tiene 22 sitios CPG,5 de los cuales están ubicados en el exón.1

Hasta el momento se han descrito más de 500 mutaciones en el gen de la PHA, distribuidas a lo largo de los 13 exones, aun que es en el exón 7 donde se ha hallado un mayor número de ellas. Las más frecuentes son las 233, que producen sustitución de un aminoácido. Se han descrito 50 deleciones, 45 mutaciones que producen un procesamiento erróneo del pre ARNm, 22 además de la sustitución de un aminoácido por un codón de parada, y 5 inserciones, se han encontrado 24 polimorfismos, que no causan afección. Aproximadamente el 10 % de estas mutaciones han sido descritas en regiones llamadas “Islas CpG” (CpG Island), que son regiones altamente susceptibles de sufrir cambios por la presencia de dobletes CpG.2

Las hiperfenilalaninernias (HFA), se producen por mutaciones en el gen que codifica para la enzima fenilalanina hidoxilasa, que actúa sobre la conversión de fenilalanina a tirosina; como consecuencia se acumula la fenilalanina en el organismo y se produce, como signo clínico principal, retardo mental, el grado de retardo mental va a estar de acuerdo con la mutación que es la que define que la enzima tenga más o menos actividad; cuando los casos son más severos, se conocen como fenilcetonuria. Se pueden diagnosticar mediante pruebas que detecten la presencia de fenilalanina en la sangre, como el método microbiológico de Guthrie,3 que consiste en la toma de sangre capilar de los niños al nacimiento y se compara el nivel de crecimiento inducido por la muestra con los niveles estándar en una cepa de la bacteria Bacillus subtilis que requiere fenilalanina para su crecimiento.

El pesquisaje neonatal es el mejor método para la detección temprana de las HFA. En Cuba, a partir de 1984 en el marco del programa de diagnóstico y prevención de enfermedades hereditarias, comienza a realizarse el pesquisaje de PKU mediante la mencionada prueba.4 Se han diagnosticados 28 niños con PKU y 56 con HFA persistente en toda Cuba.

Todos los casos detectados se encuentran bajo tratamiento dietético para evitar el retraso mental, aunque en la actualidad en muchos países desarrollados, el tratamiento se realiza de forma más individualizada, conociendo la mutación al nivel del gen y así poder correlacionar genotípofenotipo, para poder darle el tratamiento más acorde con la mutación que presenten los pacientes. Con este objetivo es que se decidió realizar este trabajo, para conocer las mutaciones de los casos de PKU y de HFA y así poder ofrecer una mejor atención a los pacientes detectados por el Programa Nacional de Detección Precoz de la Fenilcetonuria.

Métodos

En este estudio analizamos DNA genómico obtenido a partir de sangre periférica de 28 PKU y 42 familiares de éstos procedentes de diferentes provincias de nuestro país, 20 de los cuales se detectaron neonatalmente por el Programa de Fenilcetonuria, el resto fueron casos que se diagnosticaron tardíamente, pues nacieron antes de existir dicho Programa.

Para realizar el DGGE se amplificaron mediante la técnica de reacción en cadena de PCR, según Pérez B y otros los 13 exones de la PHA, con sus correspondientes secuencias intrónicas adyacentes, y posteriormente se aplicaron en geles desnaturalizantes de ureaformamida de 0 a 80 %, tras la generación de heteroduplex, lo que permitiría detectar todas las variaciones de secuencia presentes en estos fragmentos del gen de todas las variaciones de secuencia presentes en estos fragmentos del gen de la PHA. Tras el análisis por DGGE,6 aquellos exones con patrones de bandas aberrantes se secuenciaron directamente en un secuenciador automático ALF express DNA. Sequencer, utilizando un kit de reactivos Promega. En algunos casos por la reproducibilidad del método, el patrón de bandas obtenido en la DGGE nos permitió determinar directamente la mutación, al comprar los patrones obtenidos con las mutaciones detectadas anteriormente, y no fue necesario secuenciar dicho exón.

Resultados

En la tabla 1, se puede observar el total de mutaciones por exones. En ésta se aprecia que el mayor número corresponde al exón 7.

Tabla 1. Mutaciones por exones

Exón

No. de mutaciones

7

28

10

6

11

4

12

1

3

7

5

1

6

2

2

1

Total de cromosomas independientes estudiados: 56.
Total de mutaciones identificadas: 51 % de mutaciones encontradas: 90

En la tabla 2, se pueden ver las 16 mutaciones diferentes encontradas en los diferentes exones del gen de la PHA. Se observa que las más frecuentes fueron la E280k y la R261Q.

Tabla 2. Tipos de mutaciones hallados

Mutación

Cantidad

Fenotipo

E280 K

11

Severo

R261Q

9

Severo

I65T

3

Moderado

IVS-10

4

Severo

R252W

3

Severo

R68S

4

Moderado

R243X

2

Severo

IVS-12

1

Severo

F39L

1

Moderado

L248V

1

Moderado

S349

1

Severo

R15Q

1

Severo

V38M

4

Moderado

R76X

2

Severo

40SW

3

Severo

A403V

1

Benigno

Total de mutaciones diferentes: 16.
Resultaron ser las más frecuentes en Cuba la E280K(19,3 %) y la R261 Q(16 %).

Discusión

En el estudio se identificaron el 91 % de las mutaciones de los 28 PKU estudiados, para un total de 51 cromosomas indepen-dientes de un total de 56. La mayoría de las mutaciones se verificaron en el exón 7, con un total de 28 (tabla 1), para coincidir con lo que está reportado en la literatura médica.7

Se hallaron 16 mutaciones diferentes y fueron las más frecuentes la E280k y la R261 Q, la cual es originaria de Galicia (tabla 2), también se puede observar en la tabla, el fenotipo que producen estas mutaciones. En el estudio molecular, de 42 padres de los PKU se comprobó el carácter de la herencia mendeliana de las mutaciones encontradas. En la distribución de las mutaciones por provincias, se destacan. Holguín, y fue la mutación más frecuente la E280K (45,4 %) y la Habana co la R261 Q (27,7 %).

De los PKU cubanos analizados (28), 20 de ellos fueron detectados por el Programa de Fenilcetonuria, neonatalmente, de un total de 23, con posibilidades de diagnóstico. Las mutaciones más frecuentes en Cuba (E280 K y R261Q) difieren de las de España (IVS-10, A403V, V388M, I65 T,8 y América Latina (IVS10, V388, 165T, R243Q, R408W e IVS-12,9 lo cual puede ser porque las migraciones hacia Cuba, se originaron de parte de España diferentes a las de América Latina. Se encontró el 20 % de consanguinidad en los padres de los casos analizados, lo cual también puede ser parte de la explicación de la alta frecuencia de las 2 mutaciones mencionadas anteriormente. Se demostró la herencia mendeliana de las mutaciones halladas en el estudio de 84 cromosomas de los 42 padres estudiados. Resultó interesante que una de las madres estudiadas, presenta fenilcetonuria atípica, y es homocigótica para la mutación V388M, que en homocigosis, produce un fenotipo intermedio. También se halló que el caso número 33 era efectivamente portador de 2 mutaciones que producen hiperfenilalaninemia benigna (A403V/R68S), pues la primera se considera una mutación para HPA benigna, y la segunda como una mutación que produce un fenotipo suave que, sin embargo, al estar en heterocigosis compuesta produce HPA benigna, lo que coincide con el diagnóstico realizado al nacimiento por los niveles de fenilalanina en plasma (4,9 mg %). En estos momentos se está trabajando en la correlación genotipo-fenotipo, para ajustar el tratamiento y así mejorar la atención a estos pacientes.

Agradecimientos

Expresamos nuestro agradecimiento al Centro de Biología Molecular de la Universidad Autónoma de Madrid, por su colaboración y apoyo en la realización de este trabajo. Un agradecimiento especial para las doctoras Magdalena Ugarte, Lourdes Desviat, y Belén Pérez

Referencias bibliográficas

  1. Nowacki P, Byck S, Prevost L, Scriver CR. The PAH mutation analysis consortium database: update 1996. Nucleic Acids Res 1997;25(1):139-42.

  2. Abadie V, Lyonnet S, Maurin N, Berthelon M, Caillaud C, Giraud F, et al. Gpg dinucleotides are mutations hot spot in phenylketonuria. Genomics 1989;5:935-9.

  3. Guthrie R, Susie A. A simple method for detecting phenylketonuria in large populations of newborn infants. Pediatrics 1963;32:338-43.

  4. Heredero L, Atencio G, Vega JL, Gutiérrez E. Programa para el diagnóstico precoz de la fenilcetonuria en Cuba (informe preliminar). Reb Cubana Pediatr 1986;58:27-33.

  5. Pérez B, Desviat L, Cornejo V, Ugarte M. Mutations and polymorphisms in phenylalanine hydroxylase gene in Chile. Am J Hum Genet 1995 (Suppl);57:A971.

  6. Gulberg P, Guttler F. Broad range DGGE for single-step mutation scanning of entire gene: application to human phenylalanine hydroxylase gene. Nucleic Acids Res 1994;22(5):880-1.

  7. Dworniczak B, Kalaydjieva L, Pankoke S, Aulehla-Scholz C, Allen G, Horst J. Analysis of exon 7 of the human phenylalaninc hydroxylase gene: a mutation hot spot. Hum Mut 1992;1(2):138-46.

  8. Eisensmith R, Okano Y, Dsovich M, Wang T, Guttler F, Lou. Multiple origins for phenylketonuria in Europe. Am J Hum Genet 1992;51:1355-65.

  9. Pérez B, Desviat L, Cornejo V, Ugarte M. Mutations and polymorphisms in phenylalanine hydroxylase gene in Chile. Am J Hum Genet 1997(Suppl);57:A971.

Recibido: 21 de febrero de 2002. Aprobado: 19 de marzo de 2002.
Lic. Enna Gutiérrez García. Avenida 31, No. 3102, esquina a 146, municipio Playa. Ciudad de La Habana, Cuba. mailto:rey@infomed.sld.cu Fax.7-53-33-1502

1 Licenciada en Ciencias Biológicas. Investigadora Agregada. Centro Nacional de Genética Médica.
2 Doctora en Ciencias Biológicas. Profesora Titular. Centro Nacional de Genética Médica.
3 Licenciado en Ciencias Farmacéuticas. Investigador Aspirante. Centro Nacional de Genética Médica.
4 Doctora en Medicina. Especialista de II Grado en Nutrición. Instituto de Nutrición.
©  2011  1999, Editorial Ciencias Médicas

Calle 23 # 177 entre N y O - Edificio Soto, Piso 2
Vedado, Ciudad de La Habana, CP 10400
Cuba



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